识别DNA甲基化的蛋白复合体并揭示其参与转录激活的机制探究

近年来植物DNA甲基化方向研究日趋活跃,2018年12月27日,北京生命科学研究所何新建实验室在Journal of Integrative Plant Biology (JIPB)杂志在线发表了题为“A-methylated-DNA-binding complex required for plant development mediates transcriptional activation of promoter methylated genes”的研究论文。该研究发现拟南芥中2个Su(var)3-9 同源蛋白SUVH1和SUVH3(SUVH1/3)与3个含有DNAJ domain的蛋白SDJ1、SDJ2、SDJ3(SDJ1/2/3)形成SUVH-SDJ复合体,该复合体能够在全基因组水平上结合具有DNA甲基化的启动子,并且促进其中部分基因的表达,从而防止这些基因在转录水平上被沉默,对于维持植物正常的生长发育具有重要作用。

5-甲基胞嘧啶形式的DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,它能够维持转座子的沉默,维持基因组稳定性, 调控基因表达。当转座子位于基因的启动子上时,转座子上高水平的DNA甲基化通常会抑制该基因的表达。因此,阻止这种由于启动子区域DNA甲基化造成的基因沉默具有重要作用,但是目前对其分子机制知之甚少。拟南芥中的5-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶家族组分通过主动去除DNA甲基化来降低启动子区域的DNA甲基化水平,从而抑制基因的沉默。但是,DNA去甲基化机制需要对碱基进行切除修复,这有可能会造成DNA损伤,因此需要一种机制以“不改变DNA甲基化”的方式来促进启动子上含有甲基化的基因的表达。拟南芥中的一个Su(var)3-9 同源蛋白SUVH1之前作为具有“抗-转录沉默”的因子被发现(Li et al. 2016),但是对其作用机制及生物学意义并不清楚。

何新建实验室利用植物蛋白亲和纯化结合质谱分析发现SUVH1与SUVH3及三个含有DNAJ 结构域的蛋白(何新建实验室将其命名为SDJ1、SDJ2、SDJ3)在植物体内有相互作用,并通过凝胶过滤层析证明了这几个蛋白可以形成一个紧密的蛋白复合体,他们将其命名为SUVH-SDJ复合体。通过染色质免疫共沉淀结合测序(ChIP-seq)分析发现,SUVH1主要富集在基因上靠近转录起始位点的启动子区域和转座子上。通过分析SUVH1富集位点的DNA甲基化水平发现,SUVH1的富集位点具有较高的DNA甲基化水平,SUVH1在启动子区域的富集与其DNA甲基化水平呈正相关。发现SUVH1主要富集在短转座子的全长序列及长转座子的两端部分,而这些位置的CHH(H代表A、T或C)甲基化是由RNA介导DNA甲基化途径所负责的。

通过DNA甲基化分析发现,SUVH-SDJ复合体并不影响基因组DNA甲基化的总体水平,该复合体在基因组上结合位点的CHH甲基化主要依赖RNA-介导DNA甲基化途径,而不依赖负责长转座子的中间区域CHH甲基化的DNA甲基转移酶CMT2。进一步研究发现,SUVH-SDJ复合体中的其它组分也能够结合含有DNA甲基化的启动子区域。DNA甲基转移酶抑制剂处理能够部分抑制SUVH-SDJ复合体组分与染色体的结合,证明DNA甲基化是该复合体结合染色质所必需的。另外,SUVH-SDJ复合体中SUVH1/3及SDJ1/2/3与染色质的结合是相互依赖的。因此,SUVH-SDJ复合体除了能够通过SUVH1/3识别DNA甲基化结合到染色质特定位置,还可能通过识别其它染色质特征结合到染色质上的特定位置。
何新建实验室发现识别DNA甲基化的蛋白复合体并揭示其参与转录激活的机制

图 1 SUVH-SDJ复合体激活基因转录模式图

通过对SUVH1富集的启动子所对应基因的转录水平进行分析发现,在SUVH-SDJ突变体中,很多基因的转录水平是显著下降的,揭示了该复合体对于维持其靶基因的转录是必需的。但是,在SUV-SDJ突变体中,其靶基因区域的DNA甲基化并没有显著改变。利用双荧光素酶报告基因检测系统进行分析,发现这SUVH-SDJ蛋白复合体的各组分都有不同程度的转录激活活性。这些结果表明,SUVH-SDJ复合体可以结合甲基化启动子,在不改变DNA甲基化的情况下直接激活基因转录(图1)。

但是,SUVH-SDJ复合体发挥功能的方式并非与DNA去甲基化机制完全没有关系。在SUVH-SDJ突变体中,负责DNA甲基化去除的5-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶基因ROS1的转录水平显著下降。在ROS1的启动子上有一段甲基化的DNA序列,该序列作为DNA甲基化的传感器来调控ROS1的表达,进而影响DNA甲基化水平及基因转录。ChIP-seq结果表明,SUVH1在该段DNA序列上有明显富集,由此说明,SUVH-SDJ复合体通过结合ROS1启动子上一段甲基化的DNA序列来直接激活ROS1的表达,然后介导DNA去甲基化,从而抑制ROS1靶向基因的转录沉默(图1)。对于依赖DNA去甲基化与不依赖DNA去甲基化的“抗-沉默”机制之间的关系有待未来工作的进一步研究。

上海植物逆境生物学研究中心的雷明光实验室和朱健康实验室的合作研究与何新建实验室的研究同时在线发表在JIPB杂志。在雷明光实验室和朱健康实验室的合作研究中,将suvh1单突变、suvh3单突变、suvh1; suvh3双突变引入35S-SUC2报告系统和2×35S-HPTII报告系统,发现suvh1和suvh3都具有“抗-基因沉默”的功能,并且他们的功能相互冗余,并且一些内源位点的转录水平在suvh突变体中显著下调。此外,他们通过酶切PCR及亚硫酸盐测序发现在suvh1;suvh3双突变体以及suvh1;suvh3;suvh7;suvh8四突变体中,一些位点的DNA甲基化水平有所上调,并且有67%的上调位点的DNA甲基化水平在ros1-4突变体中也上调。而且,ROS1的转录水平在这些突变体中是下调的。他们还发现SUVH3结合ROS1启动子上DNA甲基化传感器序列,并促进ROS1的转录。此外他们通过亲和纯化和质谱分析发现SUVH1、SUVH3与3个含有DNAJ 结构域的蛋白相互作用。最终得出结论:RNA介导DNA甲基化途径增加ROS1启动子上DNA甲基化传感器序列的甲基化,从而确保SUVH蛋白复合体结合ROS1的启动子,促进ROS1的表达;而ROS1可以使DNA甲基化传感器序列的甲基化水平降低,从而减少SUVH复合体与其结合,进而抑制DNA去甲基化。

值得注意的是,2018年12月7日,美国加州大学洛杉矶分校美国科学院院士Steven Jacobsen 实验室及其合作者在SCIENCE杂志发表了相似的研究成果(Harris et al. 2018)。何新建实验室的独立研究一方面与Jacobsen实验室的研究的主要研究结论相同,即SUVH-SDJ复合体通过结合甲基化启动子激活基因表达;另一方面,何新建实验室的研究与Jacobsen实验室的研究相比有几个创新点:1、何新建实验室发现suvh1;sdj1;sdj3;SDJ2+/-突变体植株矮小,并且suvh1;sdj1;sdj3;sdj2四突变致死,由此说明SUVH-SDJ复合体对于维持植物体正常的生长发育具有非常重要的作用。2、Jacobsen 实验室发现了DNAJ1和DNAJ2(何新建实验室分别将其命名为SDJ1、SDJ2),而何新建实验室还另外发现了SDJ3,并且SDJ3在3个SDJ蛋白中作用关键。3、何新建实验室发现SDJ蛋白的PHD finger负责介导SUVH蛋白与SDJ蛋白的相互作用以及SUVH-SDJ复合体的形成,而且当其突变后,SUVH-SDJ复合体的功能受到了影响。4、Jacobsen 实验室报道SUVH蛋白通过结合甲基化DNA将DNAJ1和DNAJ2招募到染色质上,但是只有体外实验证据的支持;何新建实验室通过体内实验发现,SUVH蛋白与SDJ蛋白对于对方结合染色质的能力是相互依赖的,由此推测SUVH-SDJ复合体结合染色质不仅需要SUVH1/3结合甲基化的DNA,还需要SDJ1/2/3识别其它未知染色质特征。

北京生命科学研究所何新建实验室的博士研究生赵强强是该论文的第一作者,何新建博士是通讯作者,林荣楠对数据进行了生物信息学分析。北京生命科学研究所的蛋白质组中心也参与了该研究。该研究得到了科技部和北京市政府的资助,在北京生命科学研究所完成。

参考文献
Li S, Liu L, Li S, Gao L, Zhao Y, Kim YJ, Chen X.(2016) SUVH1, a Su(var)3-9 family member, promotes the expression of genes targeted by DNA methylation. Nucleic Acids Res. 44(2):608-620.

Harris CJ, Scheibe M, Wongpalee SP, Liu W, Cornett EM, Vaughan RM, Li X, Chen W, Xue Y, Zhong Z, Yen L, Barshop WD, Rayatpisheh S, Gallego-Bartolome J, Groth M, Wang Z, Wohlschlegel JA, Du J, Rothbart SB, Butter F, Jacobsen SE. (2018) A DNA methylation reader complex that enhances gene transcription.Science362(6419):1182-1186.doi: 10.1126/science.aar7854.

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